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　　本生帶您了解：ELISA實驗中常見問題和注意事項
 

　　用于ELISA測定的臨床標本最為常用的是血清(漿)。本實驗室用ELISA測定乙肝兩對半，甲肝，戊肝，抗HIV的標本時，在處理和保存方面要考慮以下幾個方面：

　　1)要注意避免出現(xiàn)嚴重溶血及血清中混有紅細胞。當標本出現(xiàn)嚴重溶血及血清中混有紅細胞時，反應(yīng)孔不易洗凈，殘留在反應(yīng)孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶的活性，顯色時可能造成假陽性。

　　2)標本凝固不全強行離心，造成血清中含有少量的纖維蛋白原，在實驗過程中形成纖維蛋白吸附在反應(yīng)孔孔壁上不易洗掉，易造成假性結(jié)果。

　　3)血清標本可在2～8℃下保存1周。如血清樣本需長時間保存，則需放入-20℃冰柜內(nèi)冰凍保存。冰凍保存的血清標本須注意避免反復凍融，標本可能引起假陰性結(jié)果。此外凍融標本的混勻不要進行劇烈振蕩，應(yīng)反復顛倒混勻。

　　ELISA測定中試劑準備：

　　在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進行測定，證試劑盒溫度要和室溫一致。如果把試劑盒從冰箱拿出來直接做實驗會造成一些弱陽性標本的檢測出現(xiàn)假陰性。因為在后面的孵育反應(yīng)步驟中，造成孵育時間不夠。其次，ELISA實驗中洗板用的洗液需每日更換配制，稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。

　　加血清樣本及反應(yīng)試劑：

　　血清樣本使用微量加樣槍加樣。使用微量加樣槍加樣必須注意避免以下幾點：

　　1)加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。需勻速加樣，吸樣時，加樣槍需按到第一檔，加樣時，加樣槍需直接按到底。

　　2)加樣應(yīng)直接加入反應(yīng)孔底部，加在反應(yīng)孔孔壁上易濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。盡量避免出現(xiàn)氣泡。

　　3)反應(yīng)試劑的加入時先要注意試劑的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易出現(xiàn)重復滴加或加在兩孔之間。

　　溫育的時間與溫度：

　　溫育是ELISA測定中最容易出現(xiàn)問題的步驟。溫育溫度應(yīng)在37℃，水浴。溫育時間應(yīng)按照試劑說明書上的時間嚴格執(zhí)行。溫育實際測定操作中要注意以下幾點：

　　1)要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時間。溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來。

　　2)因為采用水浴，所以在溫育時一定要封板，防止水蒸氣形成水滴掉入反應(yīng)孔內(nèi)造成污染，并有可能整板花板。

　　ELISA測定的洗板：

　　全自動洗板機的使用應(yīng)注意以下幾點：

　　1)洗板前，應(yīng)檢查洗液瓶、蒸餾水瓶是否充足，廢液瓶是否滿瓶

　　2)在自檢過程中注意觀察洗液灌注是否通暢，排液是否通暢。

　　3)在洗板過程中，應(yīng)注意觀察反應(yīng)孔每孔是否灌滿且無外溢，每孔吸水是否吸盡，并且要保證洗液在孔中放置的時間。

　　BUNSEN本生提醒：ELISA測定以TMB為底物的顯色

　　加入底物開始顯色反應(yīng)前，最好是先檢查一下底物溶液的有效期。滴入A、B顯色劑后，需溫育15min，最后加入終止液終止反應(yīng)，振蕩混勻后即可進行下面的比色測定判斷結(jié)果。在此過程中應(yīng)注意不要把顯色劑和終止液滴入順序弄反，否則重做實驗。

　　ELISA的比色測定

　　ELISA的比色測定由酶標儀進行測定，故需強調(diào)比色測定時，一定要注意酶標儀的波長是否是雙波長(450nm和630nm)。

　　ELISA測定結(jié)果判定

　　結(jié)果判定一般是根據(jù)比色結(jié)果和肉眼觀察綜合判定。如在判定過程發(fā)現(xiàn)有些反應(yīng)孔出現(xiàn)倒陰不陽的現(xiàn)象或出現(xiàn)不常見的模式(如乙肝兩對半中出現(xiàn)12陽性等)，需本著嚴謹?shù)膽B(tài)度，重新復查。

　　對ELISA測定中出現(xiàn)問題的可能原因(非試劑盒本身的原因)，總結(jié)如下：

　　1)弱陽性質(zhì)控樣本檢測不出溫育的時間或溫度不夠;顯色反應(yīng)時間太短;所用配制緩沖液的蒸餾水有問題。

　　2)測定的重復性差，這是由于測定操作引起的問題，包括

　?、偌訕颖炯霸噭┝坎粶?孔間不一致

　?、诩訕舆^快，孔間發(fā)生污染

　　③加錯樣本

　?、芗訕颖炯霸噭r，加在孔壁

　?、莶煌栐噭┖兄薪M分混用

　?、逌赜龝r間、洗板、顯色時間不一致

　?、呖變?nèi)污染雜物，

　　血清標本未凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細胞，易出現(xiàn)假陽性等。

　　3)全部孔都不顯色

　　①漏加酶結(jié)合物;

　?、谙窗逡号渲浦谐霈F(xiàn)問題

　?、勐┘语@色劑A或B

　　④終止劑當顯色劑使用

　　4)全部板孔均有顯色

　?、侔宀桓蓛?/p>

　　②顯色液變質(zhì)

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